1D PAGE Электрофорез

Принцип работы

Электрофорез – это разделение заряженных макромолекул в пространстве при движении их под действием электрического поля. Ключевой характеристикой определяющей возможность разделения является подвижность макромолекулы. В общем случае подвижность зависит от физического размера молекулы, ее заряда и характеристики внешней неподвижной среды, в которой молекула движется. Условно эту характеристику можно назвать «обобщенная вязкость среды» На сегодняшний день при анализе биологических молекул электрофорезом используется поддерживающая пористая среда в виде гидрофильных гелей различного происхождения и пористости. Наиболее популярные используемые гели - полиакриламидные(ПААГ) и агарозные.

Стандартным электрофоретическим методом, наиболее часто используемым в протеомике и для анализа белков, является SDS – электрофорез по Лэмли(Laemli U, 1970) в ПААГ. Этот метод использует ступенчатую буферную систему(состав буфера меняется в пространстве разделения), которая позволяет уменьшить диффузию и тем самым повысить разрешение метода. Благодаря использованию в методе SD(L)S(sodium dodecyl(lauryl)sulfate, ДДС-додецил сульфат натрия, ЛСН – лаурил сульфат натрия) – разделение белков происходит только по их размеру. SDS – является анионным ПАВ(поверхностно активное вещество) его молекулы в воде несут отрицательный заряд в широком диапазоне рН. При нагревании белков в растворе с SDS происходит практически полная их денатурация и они в присутствии SDS сорбируют на себе его молекулы так, что на единицу длины полипептидной цепи приходится практически постоянное число молекул SDS. Тем самым белки приобретают отрицательный избыточный постоянный удельный заряд (приходящийся на единицу длины (массы) белка). Собственный заряд белка при такой обработке становится практически не заметным с точки зрения его влияния на подвижность молекулы белка. Как видно из описания действия SDS, белки в методе Лэмли денатурированы и теряют свою нативную конформацию.

ПААГ готовят непосредственно перед проведением эксперимента. Из раствора(ов) акриламида и бисакриалмида. В качестве инициатора полимеризации используют персульфат аммония(ПСА), а катализатора тетраметилэтилендиамин(ТЕМЕД). Смесь для образования геля (состоящую из раствора акриламида, бисакриламида, буфера,SDS, инициатора и катализатора заливают в специально подготовленный блок(чаще всего это пластина). После изготовления (застывания, полимеризации, образования) блока геля его можно использовать для разделения в специально приспособленной для этого камере. Стандартно разделение происходит в вертикальном блоке.

Методики

Протокол SDS электрофореза по Лэмли.

Необходимые реактивы:

1. ТРИС(трис(гидроксиметил)аминометан, 2-амино-2-гидроксиметил-пропан-1,3-диол, CAS N 77-86-1) основание. Для электрофореза по Лэмли требования к Трис достаточно высоки. Использования реактива низких квалификаций типа Ч. или reagent, без дополнительной очистки недопустимо. ВНИМАНИЕ!!! Использовать солянокислую соль ТРИС – НЕЛЬЗЯ!!!
2. Акриламид. Идеальной является квалификация electrophoresis grade, но часто подходят и более дешевые марки акриламида, определить пригодность можно только экспериментальным путем. Не рекомендуется использование реактива квалификации reagent, for synthesis и тп.
3. Бис акриламид, требования к реактиву аналогичны требованиям к акриламиду
4. SDS , так же весьма желательно использование реактива квалификации for molecular biology и выше.
5. Глицин (аминоуксусная кислота) можно использовать реактив квалификации electrophoresis grade и выше, не рекомендуется использовать реактив квалификации ч. и reagent.
6. Соляная кислота квалификации ХЧ и выше.(можно использовать разбавленный до 6М реактив)
7. Персульфат аммония допустимо использование реактива ч и чда после тестирования. Так же необходимо тестировать реактив, если он хранился после даты выпуска более года.
8. Тетраметилэтилендиамин (TEMED) к нему не предъявляется очень высоких требований, но так как его расход очень небольшой, лучше использовать реактив высокого качества.
9. Глицерин можно использовать тоже без очень высоких требований - косметический , ч , чда, вполне подходят.
10. 2-Меркаптоэтанол(МЭ) или дитиотриэтол(ДТТ). К меркаптоэтанолу требования не высокие, но некоторые партии МЭ независимо от квалификации могут содержать примесь белков установить это можно только экспериментально. К ДТТ тоже требования не высокие.
11. Бромфеноловый синий без высоких требований.
12. Дистиллированная вода аналитической или фармацевтической чистоты.
13. Фильтровальная бумага.

Оборудование:

1. Камера для вертикального электрофореза с комплектом для заливки геля (стекла прокладки, устройство для заливки)
2. Блок питания постоянного напряжения с максимальным напряжением 300-400V и мощностью от 50W. Желательно что бы в блоке была стабилизация по току.
3. Автоматические пипетки со сменными наконечниками на варьируемые объемы 1-10мкл(2-20мкл), 20-200мкл, 100-1000мкл. И наконечники к ним
4. Полипропиленовые микропробирки 1.5мл(типа eppendorf)
5. Цилиндры мерные на 10, 50, 100, 250, 1000мл. Вместо 10мл и 50мл цилиндров можно использовать центрифужные полипропиленовые пробирки на 15 мл и 50мл (типа falcon) с нанесенными делениями.
6. Весы лабораторные с минимальным пределом взвешивания 0.5г и максимальным 500г, с ценой деления 10мг
7. рН метр с ценой шкалы 0.01рН
8. Пипетки стеклянные, градуированные на слив 5 и 10мл
9. Общелабораторная посуда: Стаканы термостойкие, воронки, стеклянные палочки, банки для растворов с пробками и тд.
10. Водяная баня со штативом под микропробирки 1,5 мл или твердотельный термостат с гнездами под те же пробирки.
11. Магнитная мешалка (можно самого начального уровня) с набором магнитных якорей в полипропиленовой или политетерафторэтиленовой оболочке

Приготовление запасных растворов:

1)10%SDS 200мл

Взвесить 20г SDS, перенести количественно (ополаскивая небольшим 5-10мл количеством воды посуду для взвешивания и собирая промывки в посуде для приготовления. Посуда для приготовления должна содержать надежную метку, указывающую объем 200мл. Поместить в посуду для приготовления чистый якорь для магнитной мешалки и при постоянном перемешивании добавить сначала примерно 100мл воды, а потом при постоянном перемешивании постепенном растворении довести объем раствора водой до метки 200мл и дождаться полного растворения. Извлечь якорь и довести объем до метки 200 мл, размешать раствор стеклянной палочкой. Перенести раствор в посуду для хранения с герметичной пробкой. Хранить при комнатной температуре, в холодильнике выпадает в осадок.

2)30/1 акриламид(АА30/1) 100мл

Взвесить 29г акриламида, перенести количественно в посуду для растворения. Взвесить 1 г бисакриламида и перенести количественно в посуду для растворения. Посуда для растворения должна иметь надежную метку, соответствующую объему 100мл.

Добавить 50 мл воды, нагретой до 50-60⁰С погрузить чистый якорь магнитной мешалки медленно при постоянном перемешивании и растворении добавлять воду до метки 100мл дождаться полного растворения. Извлечь якорь довести объем до метки 100 мл водой и размешать стеклянной палочкой до гомогенного состояния. Перелить раствор в посуду для хранения с герметичной пробкой хранить на температуре +8-10⁰С (нежелательно хранить при более низкой температуре, может выпасть осадок.)

3)1.5М Трис-HCl pH=8.8(Трис-8.8) 100мл

Взвесить 18.2г Трис –основания. Перенести количественно в посуду для приготовления, которая имеет надежную метку объема 100мл. Добавить примерно 60мл воды погрузить в раствор чистый якорь магнитной мешалки. Поставить посуду с раствором на магнитную мешалку и включить перемешивание добиться регулировкой оборотов небольшой скорости перемешивания от 40 до 90 об/мин. Осторожно (что бы на повредить электроды якорем) погрузить в раствор электрод(ы) работающего рН-метра и приступить к подведению рН с помощью медленного, по каплям добавления концентрированной или 6М соляной кислоты до значения 8.8. Трис относительно медленно реагирует с соляной кислотой, поэтому рекомендуется оставить раствор на ночь и проверить его рН на следующий день. При необходимости подвести рН раствора. После того как вы довели рН до величины 8.8, доведите водой объем раствора до отметки 100мл при постоянном перемешивании извлеките якорь и снова добавьте воды до отметки, перемешивая раствор стеклянной палочкой. Перенесите раствор в посуду для хранения с герметичной пробкой. Раствор рекомендуется хранить в холодильнике при температуре 4-10⁰С

4)Раствор 0.625М Трис-HCl рН-6.8(Трис-6.8) 100мл

Взвесить 7.57г Трис основания. Перенести количественно в посуду для приготовления, которая имеет надежную метку объема 100мл. Добавить примерно 45-50мл воды погрузить в раствор чистый якорь магнитной мешалки. Поставить посуду с раствором на магнитную мешалку и включить перемешивание. Добиться регулировкой оборотов небольшой скорости перемешивания от 40 до 90 об/мин. Осторожно (что бы на повредить электроды якорем) погрузить в раствор электрод(ы) работающего рН-метра и приступить к подведению рН с помощью медленного, по каплям добавления концентрированной или 6М соляной кислоты до значения 6.8. Трис относительно медленно реагирует с соляной кислотой, поэтому рекомендуется оставить раствор на ночь и проверить его рН на следующий день. При необходимости подвести рН раствора. После того как вы довели рН до величины 6.8, доведите водой объем раствора до отметки 100мл при постоянном перемешивании извлеките якорь и снова добавьте воды до отметки, перемешивая раствор стеклянной палочкой. Перенесите раствор в посуду для хранения с герметичной пробкой. Раствор рекомендуется хранить в холодильнике при температуре 4-10⁰С

5)10% раствор персульфата аммония(ПСА) 10мл

Взвесить 1г персульфата аммония в новой или чистой и сухой пробирке из полипропилена типа falcon. Добавить в пробирку воды до отметки 7мл, закрыть герметичной пробкой и интенсивно встряхивая, перемешать. Поставить пробирку вертикально и дать стечь раствору вниз 10 минут. Довести объем раствора водой до отметки 10мл и снова перемешать. Перенести раствор в посуду для хранения с герметичной пробкой. Раствор хранить в холодильнике при температуре 4-10⁰С

6)10х Электродный буфер 1л

Взвесить 144г глицина и 30г Триса-основания. Перенести количественно в посуду для приготовления, имеющую надежную метку объема 1л. Добавить 0.7л дистиллированной воды, погрузить в раствор чистый якорь магнитной мешалки поставить раствор в посуде на мешалку и перемешивать до растворения, затем при перемешивании довести объем раствора до 1л водой. Извлечь якорь, проверить объем, при необходимости довести до 1л и перемешать стеклянной палочкой. Перенести раствор в посуду для хранения с герметичной пробкой. Раствор рекомендуется хранить в холодильнике при температуре 4-10⁰С

Буфер для проб

Однократный буфер 20мл

Возьмите мерный цилиндр на 25 мл или полипропиленовую пробирку на 50 мл с делениями (типа falcon)

Добавьте

2мл Трис-6.8

5мл 10%SDS

2мл глицерина

10 мг БФС(бром феноловый синий) можно примерно на глаз

Доведите объем раствора до 20мл, перемешайте встряхиванием. Хранить при комнатной температуре.

3х Буфер для проб 10 мл

Возьмите полипропиленовую пробирку на 15 мл с градуировкой, типа falcon

Добавьте:

3мл Трис-6.8

Взвесьте и перенесите количественно 750мг SDS в пробирку

Добавьте 3мл глицерина

Добавьте 15мг БФС (можно приблизительно не глаз)

Доведите раствор горячей водой(50-80⁰С) до объема 10мл и перемешайте встряхиванием.

Проведение электрофореза по Лэмли

Приготовление разделяющего геля.

Внимание!!! Все растворы для приготовления перед смешением должны иметь комнатную температуру

Раствор для геля 10мл:

Возьмите любой сосуд, вмещающий в себя 10-15 мл раствора.

Добавьте

2.5 мл Трис рН-8.8 и необходимое для нужной концентрации акриламида( см Таблица) количество раствора акриламида АА30/1 и воды.

Таблица

Концентрация геля, %	6	7	8	10	12	15	20
Объем АА30/1, мл	2	2.33	2.67	3	4	5	6.67
Объем воды, мл	5.29	4.96	4.62	4.29	3.29	2.29	0.62

Перемешать (без пузырей) раствор

Добавить 100 мкл 10% SDS, перемешать без пузырей

Собрать блок для заливки геля

Добавить в раствор для геля сначала 100 мкл 10%ПСА и затем 10мкл ТЕМЕД аккуратно размешать без пузырей и залить в блок для геля (в зависимости от конструкции наслоить на поверхность раствора в блоке небольшое количество воды). Дождитесь полимеризации геля.

Приготовление концентрирующего геля 5мл

В посуду 10-15 мл

Добавьте 1мл Трис рН-6.8

0.75мл АА30/1

И 3.145 мл воды

Аккуратно перемешайте раствор без пузырей

Добавьте 50мкл SDS, перемешайте без пузырей

Возьмите блок с заполимеризовавшимся разделяющим гелем, удалите из него лишнюю воду путем стекания на фильтровальную бумагу. Подготовьте гребенку. Подготовьте блок к заливке концентрирующего геля. Добавьте к раствору для концентрирующего геля 50 мкл 10% ПСА и 5 мкл ТЕМЕД аккуратно (без пузырей) перемешайте и залейте в блок вставьте гребенку для образования карманов в геле в блок. Дождитесь полимеризации концентрирующего геля.

Подготовка проб.

В «сухую» безводную пробу или в осадок белков в микропробирке 1.5мл добавляют однократный буфер для проб. Затем в вытяжном шкафу добавляют 2-10%об меркаптоэтанола. Пробу интенсивно встряхивают (или пипетируют автоматической пипеткой) и помещают в кипящую водяную баню или термостат на 100⁰С, время инкубации от 5 до 30минут. После инкубации пробы центрифугируют при 10000-12000g от 30 секунд до 15 минут в зависимости от того, как они растворились. Вместо МЭ можно использовать 100-200мМ конечную концентрацию DTT из стокового 1М раствора(хранить на -20 в герметичной таре залитой под пробку. Перед употреблением разморозить и взболтать, затем отобрать небольшой объем и нагреть до 50-60⁰С и внести в пробу необходимый объем.

Жидкая проба

В жидкую пробу (раствор белка) добавляют половину объема пробы трехкратного буфера для проб, далее добавляют 2-10%об от общего объема меркаптоэтанола. Далее поступают аналогично «сухой» пробе.

Проведение электрофореза

Поместите залитый блок в камеру приготовьте электродный буфер в объеме необходимом для камеры. Для этого 10х электродный буфер надо развести в отношении 1:9. Залейте электродный буфер в камеру. В верхнюю камеру (католит) ОБЯЗАТЕЛЬНО!!!! нужно добавить 10%SDS в объеме 0.01 объема буфера в верхней камере.

Нанесите пробы в карманы геля. Для нанесения используют микрошприц типа Hamilton на 10, 25, 50,100мкл( в зависимости от загрузок) или автоматическую пипетку со специальным оттянутым наконечником для нанесения проб в гель. Подключите камеру к блоку питания. Обычно используется три режима в течение хода электрофореза:

1)Вхождение проб в концентрирующий гель. Напряжение примерно 5В/см

2)Пробы в концентрирующем геле Напряжение примерно 7-10В/см

3)Пробы вошли в разделяющий гель напряжение примерно 20-35 В/см

В см. выражена длина геля.

Окончание электрофореза контролируют при подходе фронта красителя БФС к нижней границе геля.

Окраска и дальнейшие манипуляции с гелем зависят от целей эксперимента.

Требования к образцам.

1)Для успешного проведения эксперимента. Необходимо знать количественное содержание общего белка и белка интереса в образцах.

2)В образцах не должно содержаться большое количество сильной кислоты и щелочи, более 50мМ концентрации.

3)В образцах должна отсутствовать соль в высокой концентрации, более 250мМ в пересчете на ионную силу NaCl.

4) Плохо растворимые и мембранные белки требуют модифицированных, отличных от стандартной процедуры, методик.