Окраска белковых полиакриламидных гелей с помощью серебра (щелочной метод)
Реактивы:
- Нитрат серебра хч и выше
- Насыщенный раствор аммиака хч и выше
- Лимонная кислота хч и выше
- Натрия гидрооксид чда и выше
- Метанол от чда и выше или этанол-ректификат
- Раствор формальдегида 37-40%(формалин)
Оборудование:
- Ванночка под размер геля
- Качалка или шейкер под ванночку
- Весы
- Мерные цилиндры
- Автоматические микродозаторы
- Магнитная мешалка с магнитным якорьком.
Приготовление растворов:
1) 40% об/об метанол или этанол.
Мерным цилиндром на 100 мл отмерьте 40 мл спирта и 60 мл воды смешайте их либо в бутылке, либо в стеклянном стакане. Раствор лучше всего хранить в стеклянной плотно укупоренной таре.
2) 0,1% в/о нитрат серебра
Взвесьте 50мг нитрата серебра и растворите в 50мл воды, отмеренных мерным цилиндром или взвешенных на весах. Раствор хранится в чистой стеклянной таре темнокоричневого стекла, срок хранения ограничен 3-4неделями. О невозможности использования раствора говорит его потемнение и появление металлического серебра на стенках тары.
3) 1% в/о лимонная кислота.
( В подавляющем большинстве случаев лимонная кислота поставляется в виде моногидрата. Весовые проценты рассчитывается на вес моногидрата. Не надо пересчитывать вес реактива на содержание безводной кислоты.)
Взвесьте 100мг лимонной кислоты и растворите в 10мл воды. Раствор хранится в любой плотно укупоренной таре
4) 1М раствор NaOH (гидрооксид натрия)
Взвесьте 4г гидрооксида натрия. В мерный цилиндр на 100 мл налейте 70-80мл дистиллированной воды. Небольшими порциями перенесите гидрооксид натрия в цилиндр, очень желательно добавлять каждую следующую порцию после полного растворения первой. Для ускорения растворения помешивайте раствор в цилиндре стеклянной палочкой. После полного растворения небольшими порциями воды доведите объем раствора до 100мл, после каждого добавления воды раствор надо перемешивать. Перемешанный раствор перенесите в полиэтиленовую или полипропиленовую тару с надежной герметичной крышкой для хранения. Не рекомендуется хранить раствор более нескольких месяцев.
Окраска:
1) ФИКСАЦИЯ
Извлеките гель из блока и поместите в ванночку для инкубации и залейте фиксирующим раствором 40% спирта. Поставьте ванночку на качалку. Гель качается в течение 40 минут. Через 40 минут поменяйте раствор фиксатора на свежий и опять поставьте качаться гель в фиксаторе еще на 40 минут
2) ПРОМЫВКА
Промойте гель при покачивании в дистиллированной воде два раза по 10 минут с заменой воды на свежую для второй инкубации.
3) приготовление окрашивающего раствора аммиаката серебра и окраска.
Возьмите стакан на 100мл поместите в него 50мл 0,1% раствора азотнокислого серебра аккуратно погрузите в него магнитный якорек и поставьте на магнитную мешалку. Включите перемешивание. Все дальнейшие операции необходимо проводить при постоянном перемешивании. Добавьте к 50 мл 0,1% раствора серебра 50-75 мкл насыщенного раствора аммиака. После некоторого перемешивания добавьте 0,5мл 1М раствора гидрооксида натрия, при этом в растворе выпадет бурый осадок. Медленно по каплям добавляйте в раствор насыщенный раствор аммиака, при этом бурый осадок начнет растворяться. Нельзя допустить, что бы осадок растворился полностью, раствор должен остаться слегка мутным или опалесцировать.
Поместите гель в окрашивающий раствор аммиакатов серебра. И поставьте инкубироваться при перемешивании на качалку. Время инкубации 20-40 минут.
4) ПРОМЫВКА Промойте гель дважды водой по 10 минут, как в пункте 2.
5) Проявление
приготовьте проявитель.
К 50 мл дистиллированной воды добавьте 0,5мл 1% раствора лимонной кислоты и 50мкл раствора формалина перемешайте. Замените воду в ванночке с гелем на проявитель. Проявлять надо при покачивании до первых признаков появления фона. В этот момент следует немедленно слить проявитель, и добавить к гелю 7% уксусную кислоту и тут же заменить ее на дистиллированную воду.
