Leica TCS SP5 MP

Изображение с сайта www.leica-microsystems.com

      Конфокальный микроскоп Leica SP5 на базе инвертированного микроскопа Leica DMI-6000 позволяет визуализировать пространственную структуру живого и фиксированного материала на глубину до 200 мкм. Для глубины более 80-100 мкм рекомендуется использовать реализованный на этом приборе метод двухфотонной микроскопии. Отличительной особенностью конфокальной микроскопии является возможность делать оптические "срезы" с высоким пространственным разрешением не только в плоскости, но и по глубине препарата. Полученные таким образом серии изображений могут быть использованы для трехмерной визуализации и реконструкции исследуемых объектов.

прибор может быть использован для:

• Исследования клеток и тканей в живом состоянии или на фиксированных препаратах
  
• Получения данных о распределении меченных флуоресцентными зондами веществ в нескольких измерениях (x,y,z, время, длина волны испускания, длина волны возбуждения, время жизни испускания флуорохрома)
• Специальных методов, включая FRAP, FLIP в прецезионно контролируемом объёме при использовании двухфотонного возбуждения 
• Регистрации быстропротекающих биологических процессов в клетках с использованием резонансного сканнера
  
• Детекции отдельных флуоресцентных молекул с использованием методики детекции единичных флуорохромов (SMD)
  
• Определения концентрации исследуемых веществ в живых клетках с использованием ратиометрических флуорохромов
• Определения концентрации исследуемых веществ в живых клетках с использованием времени жизни испускания (FLIM) флуорохрома (Calcium Green, FURA-2)
  
• Определения скорости диффузии биогенных молекул меченных флуоресцентными метками, определения кинетики взаимодействия меченных молекул с субстратом, доказательства мономерности или полимерности исследуемых молекул

Осветитель:

• Флуоресцентный осветитель имеет регулировку яркости излучения, систему замены лампы не требующую юстировки, соединение гибким световодом с микроскопом

• Фильтр системы:
  

• A4 (EX BP 360/40, BS 400, EM BP 470/40) DAPI, Hoechst 33258, Hoechst 33342

• E4 (EX BP 436/7, BS 455, EM LP 470) Lucifer Yellow, ACMA 
  

• N3 (EX BP 546/12, BS 565, EM BP 600/40) ALEXA 532, D-AAD, PE, TRIC 
  

• I3 (EX BP 470/40, BS 510, EM LP 515) BODIPY FL, Calcium green, DiO, FITC, Fluo3, Rhodamine 123
  

• N2.1 (EX BP 515-560, BS 580, EM LP 590) Calcium orange, Ethidium bromide, PE, PI, TRITC
  

• B/G/R (EX BP 420/30;495/15;570/20, BS 415;510;590, EM BP 465/20;530/30;640/40) DAPI/FITC/TexasRed
  

• CFP/YFP (EX BP 436/12;500/20, BS 445;515, EM BP 467/37;545/45) CFP/YFP, CFP/eYFP
  

• Время установки соседних блоков фильтров - 0,2 секунды

     В системе отсутствует УФ лазер с длиной волны 405 нм, на его место установлен блок реализации метода сверхразрешения STED-CW. При необходимости возбуждения флуорохромов светом с длиной волны менее 458 нм можно воспользоваться ИК лазером для реализации двухфотонного возбуждения, конфокальным микроскопом Leica TCS SP5 с лазером с длиной волны 405нм или использовать для подготовки препаратов другой флуорохром.

Лазеры:

• 458 нм мощностью 5 мВт

• 476 нм мощностью 5 мВт

• 488 нм мощностью 20 мВт

• 514 нм мощностью 20 мВт

• 543 нм мощностью 1 мВт

• 633 нм мощностью 10 мВт

Интенсивность излучения каждой линии плавно регулируется акустооптическим фильтром в диапазоне от 0% до 100%

• Для многофотонного возбуждения флуоресценции система оснащена импульсным фемтосекундным лазером SpectraPhysics MaiTai HP (14 W Millennia + Tsunami) перестраиваемым в диапазоне от 690 нм до 1040 нм.

• Блок "белого" лазера Leica WLL, работающего в импульсном режиме, позволяет выбрать до 8 свободно перестраиваемых лазерных линий из спектра в диапазоне от 470 до 670 нм с селективностью 0,6 нм

Блок сканера:

• Обеспечивает поточечное конфокальное сканирование

• Содержит систему светоделителя, позволяющую использовать для возбуждения флуоресценции любое сочетание лазерных линий с селективностью 2 нм

• Система светоделителя одновременно отделяет излучение флуоресценции и 8 линий лазеров

• 5 внутренних детекторов сканера обеспечивают регистрацию флуоресценции в спектральном диапазоне от 400 нм до 800 нм, с независимой регулировкой

• 2 внешних детектора на основе лавинных фотодиодов, с квантовой эффективностью до 50%, подключённые через порт расширения X1 с набором светофильтров:
• CFP/YFP (BS 470, BP 422-448, BP 500-550)
• CFP/RFP (BS 560, BP 470-550, BP 607-683)
• CY2/CY5 (BS 620, BP 485-550, BP 665-705)
• FITC/TRIC (BS 505, BP 467-499, BP 535-585)
• DAPI/ATTO647 (BS 620, BP 420-550, BP 665-705)
• Поляризационный делитель на 2 порта (440-650)
  
• Пустой держатель для установки собственных дихроиков и фильтров (2шт)
  

• Система детектора сканера позволяет устанавливать ширину полосы чувствительности каждого конфокального детектора с плавной регулировкой с разрешением 5 нм, шагом установки 1 нм

• Блок конфокального сканера позволяет поворачивать поле сканирование на 200° по и против часовой стрелки

• Оптическая система блока конфокального сканера позволяет изменять масштаб изображения в диапазоне от 1,7x до 64x

• Режим высокой детализации сканирования - регистрация протекающих событий с высокой степенью детализации при высокой скорости

• Минимальная скорость сканирования линии 1 Гц

• Максимальная скорость сканирования линии 16 кГц

• Максимальный размер кадра 8192x8192 точек

• Частота обновления для кадра размером 512х512 точек - 5 Гц

• Поле зрение в пространстве объектов 12,5 мм по диагонали

• В системе присутствует детектор проходящего света (TLD) и 2 внешних неконфокальных детектора флуоресценции (недесканируемые детекторы, NDD-RLD) с набором светофильтров:

• CFP/YFP (SP 680, BS 505, BP 483/32, BP 535/30)
• FITC/TRIC (SP 680, BS 560, BP 525/50, BP 585/40)
• FITC/TexasRed (SP 680, BS 560, BP 525/50, BP 617/73)
• DAPI/FITC (SP 680, BS 495, BP 460/50, BP 525/50)

Объективы

• 5x с числовой апертурой 0.15 безимерсионный, HCX PL FLUOTAR
  

• 10x с числовой апертурой 0.40 безимерсионный, оптимизирован для работы в спектральном диапазоне от 480 нм до 700 нм, HCX PL APO CS
  

• 20x с числовой апертурой 0.70, иммерсионные среды: вода, глицерин, масло, оптимизирован для работы в спектральном диапазоне от 480 нм до 700 нм HCX PL APO CS

• 40x с числовой апертурой в диапазоне от 1.3 с использованием масляной иммерсии, оптимизирован для работы в спектральном диапазоне от 480 нм до 700 нм HCX PL APO CS

• 63x с числовой апертурой 1.2 с ручной коррекцией сферической аберрации, водная иммерсия, специальная коррекция для GFP и DsRed HCX PL APO CS

• 63x с числовой апертурой 1.30, состав иммерсионной среды глицерин/вода 80/20 %, рабочее расстояние 0,28 мм, толщина покровного стекла в диапазоне от 0,14 до 0,2 мм, скорректирован в диапазоне от 450 нм до 800 нм, для света с длиной волны 380 нм коэффициент пропускания 50% HCX PL APO

• 100x с числовой апертурой 1.4, масляная иммерсия, оптимизирован для работы по методике STED-CW  HCX PL APO Orange
  

Реализация методов наблюдения в проходящем свете:

• Светлое поле

• Поляризация

• Дифференциально-интерференционный контраст

Микроскоп имеет систему моторизированного перемещения препарата по трём пространственным осям:

• Моторизированное перемещение препарата вдоль оси объектива 1,5 мм, с шагом 10 нм

• Моторизированное перемещение препарата в плоскости препарата в диапазоне 120/102 мм (по осям X/Y соответственно), с точностью 3 мкм, с повторяемостью 1 мкм, с максимальной скоростью со скоростью 10 мм/с

• Держатель препаратов позволяет наблюдать препараты как на предметных стёклах так и в чашках Петри

• Моторизированные узлы микроскопа управляются как органами управления микроскопа, так и программно командами от компьютера

• Система управления микроскопа имеет возможность сохранения и восстановления настроек микроскопа, включающих в себя положение фильтров, апертур и оптических элементов реализующих методы контрастирования, напряжения накала лампы и состояния затворов, в зависимости от используемого объектива и применяемого метода наблюдения

Программное обеспечение системы позволяет проводить сканирование в следующих режимах (x,y- координаты в плоскости препарата, z- координата вдоль оси объектива (глубина), t- время, λ- длина волны регистрируемой флуоресценции):

• 2D: x-y, x-z, x-t,

• 3D: x-y-z, x-y-t, x-y-λ, x-λ-Λ

• 4D: x-y-z-t,  x-y-z-λ, x-y-λ-Λ

• 5D: x-y-z-λ-Λ, x-y-z-λ-t

Программное обеспечение системы содержит модули

• визуализации трёхмерных изображений

• фиксации событий развивающихся во времени

• фиксации длительно протекающих процессов в разных областях препарата.

• анализа взаиморасположения нескольких флуорохромов

• численного восстановления изображения (деконволюции)

Программное обеспечение системы позволяет экспортировать полученные изображения в форматах LEI, LIF, TIFF, AVI, JPEG и др.

Дополнительное оснащение микроскопа:

• система сверхразрешения Leica STED-CW - позволяет работать с живыми клетками и получать изображения 512х512 точек, 18 кадров/с, с паспортным разрешением 80нм (установленная система показала разрешение в 73нм). Возможно использование флуоресцентных белков eYFP, Citrine и т. д. В будущем возможно дооснащение до gated-STED-CW, что позволит повысить разрешение до 50нм.
  
• система флуоресцентной корреляционной спектроскопии/флуоресценции времени жизни FC(C)S FLIM Leica SMD FLCS - позволяющая проводить исследования времени затухания флуоресценции (FLIM), флуоресцентной корреляционной и кросс-корреляционной спектроскопии (FCS, FCCS, FLCS http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/confocal/methods/flim/  )
• установка «белого» лазера Leica WLL  -   свободно настраивающийся, импульсный лазер, позволяет проводить FLIM эксперименты в диапазоне 470–670 nm и проводить сканирование в режиме лябмда-квадрат (сканирование с изменением возбуждения 470–670 nm, с изменением детекции 475-700нм).

     Суть конфокального принципа состоит в том, что используется диафрагма с крошечным отверстием (пинхол), расположенная в плоскости, сопряженной с плоскостью фокуса объектива. Для построения изображения подобной системой производится поточечное сканирование образца либо за счёт его перемещения, либо за счёт системы отклонения лучей в двух плоскостях. Полученные данные о яркости флуоресценции в каждой точке препарата сохраняются компьютером для последующего построения изображения. Процесс сканирования позволяет произвольно выбирать размер сканируемого участка, что даёт возможность плавного изменения увеличения получаемых снимков.
      При диаметре конфокальной диафрагмы равным одному диску Эйри на детектор попадает только свет, соответствующий центральному пятну дифракционной картины точечного объекта. Это позволяет выявить дополнительные детали изображения которые в обычной микроскопии не видны виду наложения вторичных максимумов дифракционной картины ярких объектов на менее контрастные объекты. Кроме того есть возможность дополнительно повысить латеральное разрешение до 1,4 раза по сравнению с обычной микроскопией при размере пинхол-диафрагмы 0,25 диска Эйри. К немногочисленным недостаткам сканирующей конфокальной микроскопии можно отнести высокую стоимость оборудования, среднюю фототоксичность и среднюю скорость съёмки.
     Суть микроскопии с использованием мультифотонного возбуждения состоит в создании в диффракционно ограниченной точке на образце достаточной плотности фотонов для получения феномена двухфотонного возбуждения. При этом, энергия фотонов, поглощённых флуорохромом в течение короткого (1*10^-15 c) времени складывается, что даёт возможность антистоксовской флуоресценции. Преимуществами двухфотонной микроскопии можно назвать: использование инфракрасного диапазона для возбуждения, что уменьшает рассеяние и позволяет исследовать более толстые биологические объекты;  возбуждение строго ограниченной области, что предотвращает выцветание флуорохрома выше и ниже этого места; меньшую фототаксичность; возможность регистрировать весь свет от препарата, а не только свет прошедший через конфокальную диафрагму, что даёт возможность собирать больше света, используя недесканируемые детекторы.

• Краткое описание методики измерения времени флуоресценции ( FLIM ) - http://www.leica-microsystems.com/fileadmin/academy/2012/Application_Letters/AppLetter34_SMD_Label-free_FLIM.pdf 
  
• Рекомендации по флуорохромам и пробоподготовке препаратов для STED-CW микроскопии

• Методические указания по использованию прибора Leica-SP5.pdf
  

Требования к образцам