BD FACSAriaIII

bd-facs-aria-3.jpg
Изображение с сайта www.bdbiosciences.com

     Метод проточной цитометрии позволяет измерять физические и химические параметры отдельных клеток или частиц. Он основан на регистрации флуоресценции и светорассеяния от отдельных клеток или частиц, проходящих через лазерный луч в струе жидкости. Данный метод чаще всего применяется при исследовании периферической крови человека, в частности лейкоцитов. На приборе можно также исследовать диссоциированные клетки любых тканей, бактериальные клетки, микропланктон, флуоресцентные микросферы с зондами.

прибор может быть использован для:

    • анализа клеток и частиц. Позволяет идентифицировать

      • отдельные классы, подклассы, популяции, субпопуляции, измерять их поверхностные или внутриклеточные маркеры,

      • оценивать функциональное состояние клеток (митохондриальный потенциал, внутриклеточный кальций, pH) с использованием специальных ратиометрических красителей (FDA, DiOC1, JC -1 и др.) 

      • оценивать функциональное состояние клеток с помощью специфических антител к фосфорилированным и не-фосфорилированным формам изучаемых белков, 

      • проводить многопараметрический (многоцветный) анализ проб

      • проводить анализ параметров клеточного цикла и содержания ДНК в живых и фиксированных клетках

      • изучать кинетические параметры клеточных процессов (повреждение клеточных мембран, ферментативная активность)
      • исследование механизмы и стадии апоптоза с использованием разнообразных маркеров и зондов
      • изучение фагоцитоза, в том числе в нейтрофилах крови и макрофагах
      • исследование чувствительности клеток к цитостатикам путем определения уровня экспрессии белков (P-gp и др.)
      • Молекулярно-генетические исследования (изучение отдельных хромосом и экспрессии генов)
      • Проточное кариотипирование хромосом с использованием флуоресцентных зондов
    • сортировки клеток и частиц. Способен сортировать до 4 фракций одновременно из одного образца с максимальной скоростью сортировки 70000 частиц в секунду.

      Размещение: василеостровская площадка

      Статус: эксплуатация в режиме тестирования (плановое ТО)

      › Календарь занятости BD FACSAriaIII

      Основные технические характеристики

      Лазеры:

      • Фиолетовый 405 нм (мощность 50 мВт)

      • Синий 488 нм (мощность 20 мВт)

      • Красный 633 нм (мощность 18 мВт)

      Позволяют регистрировать 13 первичных параметров: 2 параметра светорассеяния (forward scatter, side scatter) и 11 параметров флуоресценции.

      Фильтры и рекомендуемые флуорохромы:

      • Для лазера с длиной волны 405 нм: одновременная регистрация сигнала от трех флуорохромов:

        545LP ----- 600/14 ----- BV605, Pacific Orange, Alexa Fluor 430
        502LP ----- 510/50 ----- BV510, V500, AmCyan, Vio-Green
                           450/40 ----- BV421, V450, Pacific Blue, DAPI, Alexa Fluor 405
        • Для лазера с длиной волны 488 нм: одновременная регистрация сигнала от пяти флуорохромов:
        735LP ----- 780/60 ----- PE-Cy7
        655LP ----- 695/40 ----- PE-Cy5, PerCP, PerCP-Cy5-5, PerCP-Vio770, 7-AAD
        610LP ----- 616/23 ----- PI, PE-CF594, PE-Texas Red
        556LP ----- 585/42 ----- PE
        502LP ----- 530/30 ----- Alexa Fluor488, FITC, CFSE, GFP
                           488/10 ----- SSC
        • Для лазера с длиной волны 633 нм: одновременная регистрация сигнала от трех флуорохромов:

        755LP ----- 780/60 ----- APC-Cy7, APC-H7, APC-Vio770
        690LP ----- 730/45 ----- Alexa Fluor700
                           660/20 ----- APC, Alexa Fluor 647

        Сопла (nozzle) для сортировки:

        70 мкм, 85 мкм, 100 мкм, 130 мкм.

        Сортировочные емкости:

        Возможность сортировки в пробирки объемами 5 мл, 15 мл, микропробирки, в 6-, 12-, 24-, 48-, 96- и 384-луночные планшеты, на стекла.

        Температура:

        Анализ и сортировка образца при температуре: 4°C, 20°C, 37°C и 42°C.

        Дополнительно: сайт компании-производителя.

         > Подробное описание технических характеристик

      Методики

      Требования к образцам

      Перед подготовкой эксперимента, планируемого проводить на проточном цитофлуориметре, необходимо:

      1. Согласовать параметры эксперимента со специалистом Татьяной Чудиновой (желательно провести согласование до закупки флуоресцентных красителей и подготовки образцов) и прислать ей подробное описание эксперимента (см. ниже). 

      2. Записаться у специалиста на работу на приборе (свободные и занятые дни вы можете увидеть в календаре занятости прибора). 

      1) Требования к образцу:

      На проточном цитометре можно исследовать только диссоциированные биологические образцы (клетки или частицы) в растворе (например, фиксаторе или буфере). Все образцы должны быть профильтрованы. Можно исследовать:

      - диссоциированные клетки любых тканей или культур

      - бактериальные клетки

      - микропланктон

      - флуоресцентные микросферы с зондами

      2) Требования к меткам:

      При работе на проточном цитометре можно использовать только флуоресцентные красители. При планировании эксперимента с использованием многоцветного анализа тщательно подбирайте комбинации флуорохромов в соответствии с установленными на приборе лазерами (на FACSAriaIII на данный момент установлены три стандартных твердотельных лазера: фиолетовый 405нм, синий 488нм и красный 633 нм) и фильтрами (см. технические характеристики)! Перед началом эксперимента выбор флуорохромов должен быть согласован со специалистом.

      Общие требования к флуорохромам, используемым для многоцветного анализа:

      - Флуорохромы должны быть биологически инертны;

      - Интенсивность флюоресценции флуорохрома, связанного с клеткой/частицей, должна быть высокой;

      - Спектральное перекрытие эмиссии флуорохромов и соответственно компенсация должны быть минимальны (см. таблицу);

      - В случае иммуногистохимического окрашивания флуорохромы должны легко соединяться с первичными/вторичными антителами;

      - Использование традиционных флуорохромов преимущественно перед использованием тандемных флуорохромов.

      Для того, чтобы подобрать флюорохромы для многоцветного анализа, которые можно использовать на нашем приборе FACSAriaIII (с учетом установленных в нем лазеров и фильтров), рекомендуем использовать BD Fluorescence Spectrum Viewer: http://www.bdbiosciences.com/research/multicolor/spectrum_viewer/index.jsp.

      Также для подбора комбинаций флуорохромов для многоцветного анализа можно использовать спектральный гид: http://www.bdbiosciences.com/research/multicolor/spectrumguide/.

      Флуорохромы, рекомендуемые использовать на данном приборе: см. выше в Основных технических характеристиках.

      3) Комплект образцов для проведения эксперимента:
      - Неокрашенный образец: 300 000 - 500 000 событий (клеток) в 1 мл раствора (PBS, BD Cell Wash, др.)
      - Образцы, покрашенный отдельно каждым флуоресцентным красителем (в случае, если нужна компенсация): 100 000 событий (клеток) в 0.5 мл раствора (для расчета компенсации).
      - Экспериментальный образец (покрашенный всеми флуоресцентными красителями): в зависимости от того, сколько событий нужно проанализировать.

      Данные значения указаны в среднем для неуникального образца. Если образец уникальный или хорошо известный (например, кровь человека) значения можно изменять.
      Оптимально предоставлять образцы в 1.5-2 мл эппендорфах или в 5 мл пробирках (12x75 мм).

      4) Описание эксперимента:
      Необходимо прислать специалисту подробное описание части эксперимента, которая будет выполняться на проточном цитометре, по электронной почте: tatiana.chudinova@spbu.ru. В описании нужно указать:
      1. Все популяции клеток, присутствующие в образце (желательно нарисовать график (SSC, FSC) популяций клеток в образце и выделить на нем интересующею вас популяцию, которую вы планируете анализировать). Либо вместо графика можно прислать перечень популяций клеток в образце с указанием размеров клеток и их относительной гранулированности.
      Пример:
      2. Исследуемые параметры: какими флуоресцентными маркерами (желательно указать производителя) они помечены.
      3. Какие лазеры и фильтры используются для регистрации каждого параметра (техн. харатеристики см. выше).
      4. По каким параметрам вы собираетесь анализировать (и сортировать) интересующие вас субпопуляции. Написать четкую схему.