BD FACSAriaIII

Изображение с сайта www.bdbiosciences.com

     Метод проточной цитометрии позволяет измерять физические и химические параметры отдельных клеток или частиц. Он основан на регистрации флуоресценции и светорассеяния от отдельных клеток или частиц, проходящих через лазерный луч в струе жидкости. Данный метод чаще всего применяется при исследовании периферической крови человека, в частности лейкоцитов. На приборе можно также исследовать диссоциированные клетки любых тканей, бактериальные клетки, микропланктон, флуоресцентные микросферы с зондами.

прибор может быть использован для:

• анализа клеток и частиц. Позволяет идентифицировать
  

• отдельные классы, подклассы, популяции, субпопуляции, измерять их поверхностные или внутриклеточные маркеры,
  

• оценивать функциональное состояние клеток (митохондриальный потенциал, внутриклеточный кальций, pH) с использованием специальных ратиометрических красителей (FDA, DiOC1, JC -1 и др.) 
  

• оценивать функциональное состояние клеток с помощью специфических антител к фосфорилированным и не-фосфорилированным формам изучаемых белков, 
  

• проводить многопараметрический (многоцветный) анализ проб
  

• проводить анализ параметров клеточного цикла и содержания ДНК в живых и фиксированных клетках

• изучать кинетические параметры клеточных процессов (повреждение клеточных мембран, ферментативная активность)
• исследование механизмы и стадии апоптоза с использованием разнообразных маркеров и зондов
• изучение фагоцитоза, в том числе в нейтрофилах крови и макрофагах
• исследование чувствительности клеток к цитостатикам путем определения уровня экспрессии белков (P-gp и др.)
• Молекулярно-генетические исследования (изучение отдельных хромосом и экспрессии генов)
• Проточное кариотипирование хромосом с использованием флуоресцентных зондов

• сортировки клеток и частиц. Способен сортировать до 4 фракций одновременно из одного образца с максимальной скоростью сортировки 70000 частиц в секунду.

Лазеры:

• Фиолетовый 405 нм (мощность 50 мВт)
  

• Синий 488 нм (мощность 20 мВт)

• Красный 633 нм (мощность 18 мВт)

Позволяют регистрировать 13 первичных параметров: 2 параметра светорассеяния (forward scatter, side scatter) и 11 параметров флуоресценции.

Фильтры и рекомендуемые флуорохромы:

• Для лазера с длиной волны 405 нм: одновременная регистрация сигнала от трех флуорохромов:
  

  545LP ----- 600/14 ----- BV605, Pacific Orange, Alexa Fluor 430

  502LP ----- 510/50 ----- BV510, V500, AmCyan, Vio-Green

                     450/40 ----- BV421, V450, Pacific Blue, DAPI, Alexa Fluor 405
  

  • Для лазера с длиной волны 488 нм: одновременная регистрация сигнала от пяти флуорохромов:

  735LP ----- 780/60 ----- PE-Cy7
  655LP ----- 695/40 ----- PE-Cy5, PerCP, PerCP-Cy5-5, PerCP-Vio770, 7-AAD
  610LP ----- 616/23 ----- PI, PE-CF594, PE-Texas Red
  556LP ----- 585/42 ----- PE
  502LP ----- 530/30 ----- Alexa Fluor488, FITC, CFSE, GFP
                     488/10 ----- SSC
  

  • Для лазера с длиной волны 633 нм: одновременная регистрация сигнала от трех флуорохромов:

  755LP ----- 780/60 ----- APC-Cy7, APC-H7, APC-Vio770
  690LP ----- 730/45 ----- Alexa Fluor700
                     660/20 ----- APC, Alexa Fluor 647

  Сопла (nozzle) для сортировки:

  70 мкм, 85 мкм, 100 мкм, 130 мкм.

  Сортировочные емкости:

  Возможность сортировки в пробирки объемами 5 мл, 15 мл, микропробирки, в 6-, 12-, 24-, 48-, 96- и 384-луночные планшеты, на стекла.

  Температура:

  Анализ и сортировка образца при температуре: 4°C, 20°C, 37°C и 42°C.

  Дополнительно: сайт компании-производителя.
  

   > Подробное описание технических характеристик
  

  Оптическая система:

  • Представлена тремя лазерами с пространственно разделенными лазерными лучами:

  1) с длиной волны 488 нм для возбуждения стандартных красителей, с мощностью 20 мВт.

  2) с длиной волны 633 нм для возбуждения стандартных красителей, с мощностью 18 мВт.

  3) с длиной волны 405 нм для возбуждения стандартных красителей, с мощностью 50 мВт.

  • Фиксированная, не требует пользовательской юстировки.

  • Позволяет регистрировать 13 первичных оптических параметров, включая 2 параметра светорассеяния и 11 параметров флуоресценции.

  • Возможно дооснащение дополнительными фотоэлектронными умножителями, дихроическими зеркалами и фильтрами для увеличения числа регистрируемых параметров флуоресценции до 18 и более.

  • Детекторная система представлена:

  • Детекторным блоком Octagon с круговым расположением шести фотоэлектронных умножителей и гнездами для восьми пар дихроических зеркал и фильтров, для регистрации бокового светорассеяния и сигнала от пяти флуорохромов, возбуждаемых лазером с длиной волны 488 нм.

  Набор дихроических зеркал 502ФНЧ, 556ФНЧ, 610ФНЧ, 655ФНЧ, 735ФНЧ и фильтров 488/10, 530/30, 585/42, 616/23, 695/40, 780/60 для регистрации бокового светорассеяния и сигнала от пяти флуорохромов (FITC, PE, PE-TR, PepCP-Cy5.5, PE-Cy7 или аналогичных), возбуждаемых лазером с длиной волны 488 нм.

  • Детекторным блоком Trigon с круговым расположением трех фотоэлектронных умножителей и гнездами для трех пар дихроических зеркал и фильтров, для регистрации сигнала от трех флуорохромов, возбуждаемых лазером с длиной волны 633 нм.

  Набор дихроических зеркал 690ФНЧ, 735ФНЧ и фильтров 660/20, 730/45, 780/60 для одновременной регистрации сигнала от трех флуорохромов (APC, AlexaFluor700, APC-Cy7 или аналогичных), возбуждаемых лазером с длиной волны 633 нм.

  • Детекторным блоком с круговым расположением трех установленных фотоэлектронных умножителей и гнездами для трех пар дихроических зеркал и фильтров, для регистрации сигнала от флуорохромов, возбуждаемых лазером с длиной волны 405 нм.

  Дихроическое зеркало 545ФНЧ, 502ФНЧ и фильтры 450/40, 510/50, 560/40 для одновременной регистрации сигнала от трех флуорохромов (PacificBlue, PacificOrange, AmCyan или аналогичных), возбуждаемых лазером с длиной волны 405 нм.

  • Детектором для регистрации переднего светорассеяния: фотодиод с фильтром 488/10 нм

  • Наименьшее регистрируемое количество флуоресцентного сигнала прибором: 85 эквивалентов FITC (флуоресцеин изотиоцианат), 30 эквивалентов PE (фикоэритрин).

  
  

  Сбор и обработка сигналов при анализе и сортировке:

  • Цифровая система регистрации сигнала с разрешением 18 бит.

  • Поддерживается регистрация значений высоты, ширины и площади пика для сигналов от единичных клеток для всех регистрируемых первичных параметров.

  • Скорость сбора данных до 70 000 событий в секунду при регистрации 8 первичных параметров

  • Сбор и анализ цитометрических данных в стандартах FCS 3.0 и FCS 2.0 (стандарты хранения данных, принятые в проточной флуорицитометрии).

  
  

  Система сортировки:

  • Сортировка клеток и частиц методом разделения капель в потоке.

  • Возможность сортировки в пробирки объемами 5 мл, 15 мл, микропробирки, в 6-, 12-, 24-, 48-, 96- и 384-луночные планшеты, на предметные стекла и другие емкости для сбора клеток поддерживается встроенным в прибор блоком ACDU.

  • Поддерживается возможность сортировки до 4 фракций одновременно из одного образца.

  • Скорость сортировки до 70 000 частиц в секунду (включительно) при регистрации 8 первичных параметров в предлагаемой конфигурации.

  • Регулировка частоты привода образования капель с максимальным значением 100 000 Гц.

  • Полупроводниковый красный лазер и встроенная CCD-камера для регистрации свечения калибровочных флуоресцентных частиц в основном и боковых потоках в процессе сортировки частиц при настройке параметра задержки капли.

  • Автоматическая система Accudrop для настройки и верификации параметра задержки капли в режиме реального времени при сортировке калибровочных флуоресцентных частиц, исключающая необходимость контрольной сортировки калибровочных частиц или клеток на предметные стекла и подсчета частиц.

  • Чистота сортировки в режиме чистого выделения клеток до 98% и более (до 99,9% в зависимости от условий эксперимента).

  • Логика сортировки на основе предустановленных шаблонов чистоты и выхода сортировки с 32 градациями тонкой настройки масок сортировки.

  • Автоматический мониторинг стабильности параметров сортировки и положения точки формирования капель в процессе работы при помощи функции SweetSpot (выполняется программным обеспечением прибора).

  • Автоматическая корректировка параметров сортировки при изменении положения точки формирования капель, выполняемая без вмешательства оператора при помощи функции SweetSpot (выполняется программным обеспечением прибора).

  • Полностью закрытая камера с регулируемым давлением для размещения пробирок с сортируемыми образцами объемами на 1,5 мл, 5 мл, 15 мл.

  • Настраиваемая остановка сортировки при риске контаминации сортируемых фракций

  • Система термостатирования сортируемого образца и собираемых фракций при работе с пробирками и планшетами: термостатирование сортируемого образца на установках температуры 4, 20, 37, и 42°C, термостатирование собираемых фракций в диапазоне до 50°C.

  • Поддерживается возможность сортировки заданного числа клеток или частиц (от 1 частицы).

  • Поддерживается возможность сортировки клеток разных субпопуляций в одну емкость для сбора фракций или в лунку планшета в соответствии с заданной оператором пропорцией.

  
  

  Гидравлическая система:

  • Проточная система на основе проточной кюветы, не требующая пользовательской настройки.

  • Поддерживается возможность автоклавирования емкостей для проточной жидкости при подготовке к стерильной сортировке.

  • Автоматические протоколы для промывки прибора перед началом и в конце работы, для дезинфекции прибора перед стерильной сортировкой, для промывки проточной кюветы и порта подачи образца – поддерживаются программным обеспечением прибора.

  • В комплект входят сменные сопла, обеспечивающие фиксированное, не требующее регулировки, положение потока на выходе из проточной кюветы.

  • Сменные сопла для сортировки в комплекте, размеры: 70 мкм, 85 мкм, 100 мкм, 130 мкм.

  
  

  Программное обеспечение FACSDIva:

  • Пакет инструментов для обработки цитометрических данных, включая инструменты гейтинга, квадрантов, регионов, расчет статистики входит в программное обеспечение FACSDiva.

  • Поддерживается возможность проведения анализа данных на основе иерархических определений клеточных популяций без использования логических комбинаций гейтов.

  • Поддерживается ведение базы данных по результатам и настройкам экспериментов с поиском по ключевым словам.

  • Автоматическая функция определения положения популяции клеток на графике при сдвиге интенсивности флуоресцентного сигнала при исследовании серии проб вы полняется программным обеспечением FACSDiva.

  • Поддерживается отображение данных на графиках с логарифмическими осями диапазона 7 декад.

  • Поддерживается функция программной компенсации взаимного влияния регистрируемых флуоресцентных сигналов.

  • Поддерживается функция настройки произвольного масштаба графиков для отображения данных, вплоть до отображения данных по единичным регистрируемым каналам.

  • Программное обеспечение для анализа клеточного цикла ModFIT.

  • Программное обеспечение для мультиплексных технологий анализа FCAPArray.

  
  

  Калибровка и настройка прибора:

  1. Программное обеспечение FACSDiva содержит встроенный протокол для автоматической проверки характеристик прибора (интенсивность, коэффициент вариации, эффективность сигнала, уровень шума) по калибровочным частицам для каждого регистрируемого параметра.

  2. Имеются встроенные в программное обеспечение FACSDiva средства ведения файлов Леви-Дженнингс по данным проведенных калибровок для мониторинга стабильности прибора.

  3. Программное обеспечение FACSDiva поддерживает автоматическую настройку детекторов и мониторинг настроек по калибровочным частицам для флуорохромов: Indo 1, DAPI, Hoechst, Pacific Blue™, AmCyan, Qdot® 655, Qdot® 700, FITC, PE, PE-Texas Red™, PerCP, PerCP-Cy™5.5, PECy™7, APC, Alexa Fluor® 700, APC-Cy7, APC-HL750, их эквивалентов и др.

  4. Программное обеспечение FACSDiva поддерживает возможность ручного подбора пользовательских настроек детекторов.

  5. Программное обеспечение FACSDiva поддерживает автоматический расчет параметров цветовой компенсации для всех возможных сочетаний регистрируемых параметров с использованием различных калибровочных материалов:

  – по контрольным клеткам, окрашенным флуоресцентными антителами,

  – по контрольным частицам, окрашенным флуоресцентными антителами.

  • Программное обеспечение FACSDiva поддерживает автоматический расчет интенсивности свечения флуоресцентных частиц в боковом и центральном потоке при калибровке параметра задержки капли.

Перед подготовкой эксперимента, планируемого проводить на проточном цитофлуориметре, необходимо:

1. Согласовать параметры эксперимента со специалистом Анной Романович (желательно провести согласование до закупки флуоресцентных красителей и подготовки образцов) и прислать ей подробное описание эксперимента (см. ниже). 

2. Записаться у специалиста на работу на приборе (свободные и занятые дни вы можете увидеть в календаре занятости прибора). 

1) Требования к образцу:

На проточном цитометре можно исследовать только диссоциированные биологические образцы (клетки или частицы) в растворе (например, фиксаторе или буфере). Все образцы должны быть профильтрованы. Можно исследовать:

- диссоциированные клетки любых тканей или культур

- бактериальные клетки

- микропланктон

- флуоресцентные микросферы с зондами

2) Требования к меткам:

При работе на проточном цитометре можно использовать только флуоресцентные красители. При планировании эксперимента с использованием многоцветного анализа тщательно подбирайте комбинации флуорохромов в соответствии с установленными на приборе лазерами (на FACSAriaIII на данный момент установлены три стандартных твердотельных лазера: фиолетовый 405нм, синий 488нм и красный 633 нм) и фильтрами (см. технические характеристики)! Перед началом эксперимента выбор флуорохромов должен быть согласован со специалистом.

Общие требования к флуорохромам, используемым для многоцветного анализа:

- Флуорохромы должны быть биологически инертны;

- Интенсивность флюоресценции флуорохрома, связанного с клеткой/частицей, должна быть высокой;

- Спектральное перекрытие эмиссии флуорохромов и соответственно компенсация должны быть минимальны (см. таблицу);

- В случае иммуногистохимического окрашивания флуорохромы должны легко соединяться с первичными/вторичными антителами;

- Использование традиционных флуорохромов преимущественно перед использованием тандемных флуорохромов.

Для того, чтобы подобрать флюорохромы для многоцветного анализа, которые можно использовать на нашем приборе FACSAriaIII (с учетом установленных в нем лазеров и фильтров), рекомендуем использовать BD Fluorescence Spectrum Viewer: http://www.bdbiosciences.com/research/multicolor/spectrum_viewer/index.jsp.

Также для подбора комбинаций флуорохромов для многоцветного анализа можно использовать спектральный гид: http://www.bdbiosciences.com/research/multicolor/spectrumguide/.

Флуорохромы, рекомендуемые использовать на данном приборе: см. выше в Основных технических характеристиках.

- Неокрашенный образец: 300 000 - 500 000 событий (клеток) в 1 мл раствора (PBS, BD Cell Wash, др.)
- Образцы, покрашенный отдельно каждым флуоресцентным красителем (в случае, если нужна компенсация): 100 000 событий (клеток) в 0.5 мл раствора (для расчета компенсации).
- Экспериментальный образец (покрашенный всеми флуоресцентными красителями): в зависимости от того, сколько событий нужно проанализировать.

Данные значения указаны в среднем для неуникального образца. Если образец уникальный или хорошо известный (например, кровь человека) значения можно изменять.
Оптимально предоставлять образцы в 1.5-2 мл эппендорфах или в 5 мл пробирках (12x75 мм).

1. Все популяции клеток, присутствующие в образце (желательно нарисовать график (SSC, FSC) популяций клеток в образце и выделить на нем интересующею вас популяцию, которую вы планируете анализировать). Либо вместо графика можно прислать перечень популяций клеток в образце с указанием размеров клеток и их относительной гранулированности.
Пример:
2. Исследуемые параметры: какими флуоресцентными маркерами (желательно указать производителя) они помечены.
3. Какие лазеры и фильтры используются для регистрации каждого параметра (техн. харатеристики см. выше).
4. По каким параметрам вы собираетесь анализировать (и сортировать) интересующие вас субпопуляции. Написать четкую схему.